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par Claire PIRIM, Cristian FOCSA, Michael ZISKIND - publié le , mis à jour le

Applications innovantes de l’ablation laser en biologie et médecine

Un axe de recherche a été initié en collaboration avec le laboratoire PRISM de Lille 1 pour développer des systèmes d’analyses d’intérêt biologique innovants basé sur les techniques d’ablation/désorption laser.

Amélioration des performances de la technique MALDI :
MASQUE et DESOLVATATION LASER

La réalisation et l’optimisation de deux dispositifs améliorant simultanément la sensibilité et la résolution spatiale des analyses MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption and Ionization) - les masques de silicium et la désolvatation laser - constitue la première étape de cette collaboration. Nous avons ainsi développé avec l’Institut d’Electronique, Microélectronique et de Nanotechnologie (IEMN, Lille 1) des systèmes de masques à apposer sur l’échantillon étudié en pratiquant des ouvertures par gravure plasma de galettes de silicium. Nous avons pu montrer que certaines configurations de masques (épaisseur, forme et taille des ouvertures, espacement entre les ouvertures) permettent d’augmenter simultanément la sensibilité (d’un facteur 2 à 5) et la résolution spatiale de la technique MALDI. Cet effet a pu être interprété dans le cadre des processus MALDI, c’est-à-dire à travers l’augmentation du rendement de la matrice ionique (ionisation primaire) et des interactions entre l’analyte et la matrice (ionisation secondaire).
Parallèlement, nous avons développé un système original permettant la désolvatation des agrégats formés dans le processus MALDI via l’implémentation d’un second faisceau laser sur notre instrument. Ce laser a pour rôle de stimuler les agrégats présents dans la plume de désorption, afin de les dissocier et libérer des ions nus analysables qui contribueront à augmenter l’intensité des pics correspondant dans les spectres de masse. Par utilisation d’un laser pulsé émettant à 532 nm il a été ainsi possible de mettre en évidence une augmentation d’un facteur 2 à 3 de l’intensité des signaux d’analyte.

Outils d’analyse et de diagnostic de tissus par ablation laser à pression et température ambiantes : LADC et SPIDERMASS

Cette collaboration se poursuit aujourd’hui avec la mise en œuvre de nouveaux outils de micro-échantillonnage de coupes de tissus par ablation laser à pression et température ambiantes. Dans le premier de ces outils, la capture dans des gouttes de solvants du matériel ablaté par un laser Nd:YAG à 532 nm permet l’introduction des composés à analyser (lipides peptides, protéines) dans le spectromètre de masse sous vide. L’optimisation de cette technique dite LADC (Laser Ablation/Droplet Capture) permet l’étude histologique d’échantillons complexes avec l’identification d’environ 400 protéines sur une région du tissu biologique de quelques centaines de micromètre de diamètre. Des développements sont en cours pour améliorer encore la sensibilité et la résolution spatiale et automatiser ces analyses pour en faire une technique d’imagerie moléculaire à l’échelle micrométrique.

Le développement d’un dispositif permettant l’analyse directe de marqueur biologique in vivo a également été initié à partir de 2012. Ce développement constitue la première marche du projet SPIDERMASS dont l’objectif est l’élaboration d’un instrument d’analyse in-vivo en temps-réel pour le bloc opératoire comme outil d’aide à la chirurgie et au diagnostic. Les tissus biologiques présentant une quantité importante d’eau (75-80%), le choix a été fait de travailler dans l’IR à la longueur d’onde correspondant au mode de vibration stretching O-H de l’eau. Cette longueur d’onde se situe vers 2,9 µm, accessible à l’OPO utilisé pour nos travaux d’intérêt atmosphérique. Ceci a permis le développement d’un premier prototype équipé d’une ligne de transfert de type Venturi placée au-dessus du point d’irradiation du laser et reliée à un spectromètre de masse modifié pour permettre l’arrivée de la ligne de transfert. Les premières expériences réalisées ont démontré la possibilité de collecter des profils à partir de morceaux de tissus (ex-vivo).

Le système a ensuite été testé en temps de réel et in-vivo sur les doigts de différents volontaires, permettant de démontrer le caractère indolore et non invasif de la technique (les marques sur les doigts disparaissent après 5 min) et l’existence de profils spécifiques au genre et/ou au traitement subi par la peau (crème antalgique ou crème hydratante).
Le premier prototype mis en place et les résultats préliminaires obtenus ont permis l’obtention de financements de l’ANR et du programmePhysique-Cancer de l’INSERM ainsi que le dépôt d’un brevet (extension internationale PCT en 2016). Le projet a également a été labélisé MATWIN en 2015. A cette occasion, il a reçu le prix du "Best breakthrough innovation" décerné par un Board International constitué des représentants de prestigieuses institutions académiques de l’Euro-région et des sociétés Leaders dans le domaine de la Pharma-Santé. La valorisation du brevet a pu être engagée à travers un programme de maturation de la SATT-Nord. Les différents financements obtenus ont notamment permis le développement d’un second prototype, fibré et transportable, actuellement utilisé en routine sur le projet. L’optimisation des divers paramètres du dispositif a également été menée à bien, conduisant à préciser les mécanismes mis en jeux lors de l’ablation laser et en améliorer grandement les performances. Elles permettent aujourd’hui la détection en positifs comme en négatifs de nombreuses classes de molécules : lipides, peptides, voire protéines.

Vidéo de démonstration du dispositif SPIDERMASS

Brevets :

  • I. Fournier, B. Fatou, M. Wisztorski, C. Focsa, M. Ziskind, M. Salzet, Dispositif d’analyse moléculaire in vivo en temps reel, F197600005/FR/BN, WO2016046748 (A1)

Publications :

  • L. Diologent, G. Bolbach, C. Focsa, M. Ziskind, I. Fournier, “Laser induced post-desolvation of MALDI clusters” , invited paper, special issue "Franz Hillenkamp Memorial", Int. J. Mass Spectrom. (in press, corrected proof 2016)
  • B. Fatou, P. Saudemont, E. Leblanc, D. Vinatier, V. Mesdag, M. Wisztorski, C. Focsa, M. Salzet, M. Ziskind, I. Fournier, "In vivo Real-Time Mass Spectrometry for Guided Surgery Application”, Sci. Rep. 6, 25919 (2016)
  • B. Fatou, M. Wisztorski, C.Focsa, M. Salzet, M. Ziskind, I. Fournier, “Substrate Mediated-Laser Ablation under Ambient Conditions for Spatially-Resolved Tissue Proteomics by Microsampling”, Sci. Rep. 5, 18135 (2015)
  • L. Diologent, J. Franck, M. Wisztorski, A. Treizebre, C. Focsa, I. Fournier, M. Ziskind, "On the origin of increased sensitivity and mass resolution using silicon masks in MALDI", Anal. Chem. 86, 1404 (2014)